Témoignage de Cytheris, partenaire et client d'ImmunID.

Dans son portefeuille de clients, ImmunID compte Cytheris, société biopharmaceutique française centrée sur la recherche et le développement de molécules innovantes pour l’immuno-modulation. Nous sommes heureux que notre expertise sur la qualité de la diversité du répertoire ait récemment pu apporter des éléments intéressants pour la caractérisation de l'action de leur candidat médicament l’IL7/CYT107 chez les patients atteints d’hépatite C virale (HCV). Voici le témoignage du Dr Thérèse Croughs, Directeur Médical chez Cytheris, sur la participation d'ImmunID dans l'étude ECLIPSE 2 menée par Cytheris, dont les résultats intermédiaires ont été présentés en novembre 2011 à San Francisco (USA), lors de la conférence de l'AASLD, American Association for the Study of Liver Diseases (communiqué de presse de Cytheris, lien vers le poster).

L'étude ECLIPSE 2 et ses résultats

Ce travail s'inscrit dans le contexte du développement de l'IL-7/CYT107, stimulateur du système immunitaire, pour un usage ciblé visant à booster la défense immunitaire spécifique contre une maladie virale chronique. L'essai a été mené en France et en Italie, avec comme Investigateur Principal le Pr Patrick Marcellin (Hôpital Beaujon Paris) et 1^er auteur le Dr François Habersetzer (Hôpitaux Universitaires de Strasbourg), chez des patients non répondeurs au traitement standard, PEG-interféron, ribavirine. Conformément aux objectifs d'une étude de phase I/IIa, le but était la tolérance en escalade de doses (3, 10 et 20 µg/kg/semaine), mais c'était également l'occasion d'observer l'action immunologique du CYT107.

Le protocole prévoyait que le « boost » immunitaire par CYT107 devait intervenir sous forme de quatre injections hebdomadaires (J0 à J21) après quelques semaines de traitement de référence pour faire chuter la charge virale. A J56 nous avons constaté avec 10 µg/Kg/semaine trois résultats principaux :

Une correction totale de la lymphopénie induite par les antiviraux, avec une augmentation des lymphocytes T CD4 (+168 %) et CD8 (+179 %) après l'administration de CYT107

Une extension significative de la diversité du répertoire des récepteurs de lymphocytes T (+25 %)

La fonctionnalité des cellules générées, comme le montre l'augmentation de 73% des CD3 exprimant les récepteurs alpha4beta7, intégrines facilitant la migration des lymphocytes, phénomène appelé homing.

Ajouté aux antiviraux, la cytokine IL-7/CYT7 a donc induit une réponse immune large et diversifiée et a éliminé le virus chez plusieurs patients.

La collaboration entre Cytheris et ImmunID au cours de cet essai

L'outil est très pratique et l'entreprise ne rend pas que des pics ! La compagnie est réactive, très professionnelle dans l'interprétation et une aide pro-active pour l'analyse des résultats.

Rôle joué par la divpénie dans l'étude ECLIPSE 2

Pour documenter l'action du CYT107, notamment sur les effets immunologiques, Cytheris a utilisé la technologie d'ImmunID pour accéder à l'analyse de la restauration du répertoire. Nous avons ainsi vu que le traitement PEG-interféron, ribavirine entrainait une baisse de la diversité immunitaire, qui a pu être restaurée chez tous les patients ayant reçu de l’IL-7/CYT107, surtout ceux ayant eu la plus faible diversité initiale (inférieure à 45%).

La restauration de la diversité traduit le fait d'avoir produit des cellules fonctionnelles, capables d'une maturation complète, avec l'amplification des clones pré-existants et l'apparition de nouveaux lymphocytes. ImmunID nous a fourni un argument scientifique intéressant pour expliquer l’impact de l'IL-7 et compléter le panel de preuves de l'activité de notre produit.

L’accord de co-marketing Européen vise avant tout à répondre aux besoins grandissants en biomarqueurs permettant de qualifier précisément le statut immunitaire d’un échantillon utilisé dans les études pré-cliniques et cliniques de la recherche académique à l’industrie pharmaceutique. Charles River qui assiste la communauté scientifique depuis la production de modèles de recherche jusqu’à la réalisation de protocoles expérimentaux pointus a souhaité compléter son offre de services avec les solutions d’immunomonitoring innovantes que propose ImmunID.

ImmunID et Charles River proposent désormais une offre de services intégrée apportant des solutions de l’in vivo à l’in vitro et intégrant notamment l’import et le développement des modèles, la collecte des échantillons et les analyses immunologiques ad hoc.

Les tests ImmunTraCkeR® et Immun’Ig® basés sur l’analyse standardisée du biomarqueur de diversité combinatoire V(D)J des répertoires des lymphocytes T et B améliorent la compréhension des mécanismes pathologiques et contribuent notamment à la qualification des modèles biologiques dans les cas de cancers et de maladies infectieuses. Ils permettent entre autre d’étudier finement l’effet immunostimulant ou immunosuppresseur d’un candidat médicament. La caractérisation du répertoire immunitaire permettra d’accélérer les activités de recherche et les études pré-cliniques pour mettre rapidement sur le marché de nouveaux candidats médicaments plus efficaces et plus sûrs pour le patient.

Dans le cadre du financement de ses projets de R&D, la société ImmunID vient de bénéficier de la dernière innovation financière mise en place conjointement par OSEO, la Place Financière de Lyon, et BNP-Paribas. Il s’agit d’un prêt d’avance sur subvention, garanti par OSEO (communiqué de presse du 14 avril 2008), qui permet d’accélérer le lancement des programmes de R&D labellisés par les Pôles de Compétitivité, dont notamment LyonBiopôle.

« Au delà du financement obtenu suite à la labellisation, un des enjeux majeurs dans le domaine de l’innovation est la vitesse. Nous sommes heureux de voir dans cet outil la concrétisation du travail réalisé dans le cadre de Lyon Place Financière et Tertiaire (http://www.lyon-finance.org) qui a su mobiliser les entrepreneurs, OSEO, la Drire, et les banquiers pour créer cette réponse simple et efficace» introduit Yves Laurent, Directeur Général du LyonBiopôle.

« Nous sommes heureux de bénéficier de ce tout nouveau produit financier facile d’accès et rapide à mettre en oeuvre, qui permet à ImmunID de gagner plus de 6 mois sur ses prévisions de démarrage de programme. Ce temps gagné favorise notre avance dans le domaine de l’immunomonitoring, et nous comptons l’utiliser pour poursuivre les développements de notre gamme ImmunTraCkeR® en médecine personnalisée», indique Nicolas Pasqual PDG d’ImmunID.

« OSEO a déjà soutenu la société ImmunID au travers du Concours national d'aide à la création d'entreprises de technologies innovantes via un prêt participatif d’amorçage, et plus récemment par l’octroi d’une aide à l’innovation. Avec ce nouveau dispositif, destiné aux projets labellisés par les Pôles de Compétitivité, OSEO souhaite apporter une réponse globale aux besoins de l’entreprise en garantissant à 50% le financement mis en place par la banque pour le préfinancement de la subvention et des éventuels besoins en fonds de roulement additionnels » complète Arnaud Peyrelongue directeur du réseau Sud Est OSEO. 

« La recherche et les technologies de pointe se développent sans cesse dans notre région. BNP Paribas, la banque d'un monde qui bouge, se devait d'accompagner encore plus, les entreprises innovantes en contribuant à l'élaboration et la réalisation de la 1ère mise en place du crédit de préfinancement des subventions" poursuit M Berger de l’agence Arc Alpin Entreprises BNP PARIBAS, avec qui a été réalisé l’opération.

« Enfin un outil financier simple et efficace pour les PMEs innovantes : si un tel produit se démocratise, il devrait contribuer activement au financement de la  R&D des PMEs en France. Pour les entrepreneurs et dirigeants de PME, il s’agit d’une aide précieuse qui permet de financer au bon moment les programmes de recherche» poursuit Nicolas Pasqual. « Lyonbiopole se réjouit de voir ce premier dossier bénéficier à une entreprise Grenobloise, et va poursuivre son action au service des PMEs de la Région Rhône Alpes, pour les aider à trouver les meilleures solutions de financement. En effet, il faut que l’entreprise puisse disposer des fonds nécessaires aux différents stades de développement. C’est une condition sine qua non pour que les entreprises innovantes puissent bénéficier des dispositifs publics de financements de la R&D afin de développer leurs projets et devenir demain, des leaders au niveau international» conclut Yves Laurent.

Contact LYONBIOPOLE Yves Laurent Directeur Général LyonBiopôle yves.laurent@lyonbiopole.com		Contact ImmunID Nicolas Pasqual PDG ImmunID npasqual@immunid.com		Contact BNP Alain Berger Banquier d'affaires alain.berger@bnpparibas.com
Lire aussi l'article de du 11/07/08		Grenoble : ImmunID ouvre la voie du préfinancement de subventions

La Société Française d’Immunologie (SFI) a organisé le lundi 26 Nov 2007 son 24ème atelier technologique à l'ENS Lyon qui traitait de l'Approche Globale des Répertoires Immunitaires: de la Recherche au Diagnostic ex-vivo. Pour la première fois, une Biotech a pleinement participé à l’organisation de l’atelier aux côtés de la SFI. Retours sur la conférence...

« L'objectif était de faire le point sur les techniques globales de l'analyse des  répertoires immunitaires (RI) en tant qu'outils de recherche, et de discuter de leur pertinence pour certaines applications au service des malades » rappelle Sylvia Cohen-Kaminsky membre du CA de la SFI. Les interventions des conférenciers ont permis de comprendre les diverses approches disponibles pour l'analyse globale des RI au plan technique et pratique, et leurs domaines d'application en recherche ainsi qu'au niveau médical. « L'idée originale de suivre le RI en immunomonitoring devrait permettre d'aider les médecins à piloter et personnaliser les traitements et les scientifiques à mieux comprendre les mécanismes d’action de ces traitements poursuit Nicolas Pasqual, responsable de la société ImmunID _Technologies, Biotech européenne innovante en immunomonitoring. Cette journée a contribué à faire un état des lieux grâce à l’expertise des scientifiques référents dans ce domaine.

Retour sur les points forts des interventions…

En guise d’introduction Sylvia Cohen-Kaminsky à travers son expérience dans la Myasthénie autoimmune a résumé les besoins du point de vu de l’utilisateur, ainsi que les questions posées face à une problématique d’analyse du répertoire T dans une situation physiopathologique donnée: a) Quels sont les tissus, cellules pertinentes pour cette analyse, est-ce que ces échantillons sont accessibles ? b) Est-ce que la chronicité des maladies représente un obstacle ou un atout pour rendre ces analyses informatives ? c) Quels domaines d’application pour quelle technologie ? d) Comment combiner les technologies pour répondre à une question scientifique ou physiopathologique ?

Dans les faits le chercheur est souvent confronté à la problématique de l’accessibilité des échantillons pertinents pour la pathologie étudiée. Il est important de sélectionner les patients inclus dans les études de RI au moins selon deux critères : un délai court entre les premiers signes de la maladie et l’analyse pour éviter la complexité due au « spreading »  d’épitope, et selon le traitement, afin d’identifier des modifications de répertoire indicatrices de la pathologie. Les effets des traitements sur le remodelage du RI est une question à aborder dans un second temps. Les échantillons étudiés sont rarement les plus informatifs. Les PBMC trop souvent utilisés ne reflètent pas la région cible de la pathologie. La microdissection laser est une approche puissante qui permet de disposer de coupes des tissus cibles, contenant des infiltrats inflammatoires lymphocytaires diffus, ou encore des formations plus organisées comme les follicules lymphoïdes tertiaires avec centres germinatifs, pour réaliser les analyses de répertoire. En contre-partie, cette approche nécessite des méthodes très sensibles. Il est envisageable que cette approche, couplée à des outils d’immunomonitoring robustes puisse révéler des relations précises entre signatures immunitaires et physiopathologie des maladies impliquant le système immunitaire, avec à la clef des outils pour le diagnostic, le pronostique et le suivi clinique de l’efficacité des traitements.

Une conférence introductive par Philippe Kourilsky a fait le point sur l'historique des méthodes d’étude du RI. En tant que véritable pionnier de l’analyse globale des RI, il a notamment présenté l’Immunoscope®, développé dès 1992 à l’institut Pasteur, en appuyant l’idée de la potentialité de son utilité en clinique humaine Son point de vue est que « La Science est belle quand elle utile, » et que « L’immunologie n’a pas rendu ce qu’on attendait d’elle vis-à-vis de la clinique » et que « oui les RI sont complexes, mais qu’il faut appréhender cette complexité de façon progressive en se donnant des instruments et des outils conceptuels ».

L’analyse du RI est une approche incontournable de l’immunomonitoring mais il reste beaucoup à faire pour fournir un outil réellement adapté aux besoins des cliniciens, en particulier coupler l’analyse du RI avec d’autres approches d’immunomonitoring et standardiser les procédures. D’après Phillipe Kourilsky, un des principaux avantages de l’Immunoscope, dont le principe est d’analyser la longueur de CDR3 au niveau des ARNm, est l’ajustement du niveau d’analyse avec des amorces nucléotidiques de plus en plus spécifiques. L’Immunoscope permet en théorie de suivre les chaînes α, β, γ, δ et IgH. Le suivi de clonotypes dits « publics » est particulièrement utile. Le fait qu’un même pic de taille puisse abriter des séquences légèrement différentes, mais de même spécificité, peut contribuer à réduire la complexité. Des traitements informatiques poussés accroissent la vitesse et la puissance d’analyse. Il est hors de doute que l’approche a été, et reste fort utile dans de nombreuses situations. Il faut reconnaître néanmoins qu’elle reste relativement chronophage et onéreuse. Plus on désire être précis, plus la méthode est lourde à mettre en œuvre. Aussi il convient de réaliser un ajustement de la technologie et du niveau de complexité. De plus, l’Immunoscope souffre de limitations intrinsèques et aurait deux « pêchés originels »: le premier est de ne pas donner accès simultanément aux deux chaînes (lourde et légère, b et a, d et g) produites par la même cellule ; le second est que la détection d’une clonalité n’indique en rien la fonctionnalité (anergie ou non, production d’interleukines, etc) des cellules exprimant un TCR donné. Enfin il faut noter que cette approche utilise des ADNc qui reflètent un état d’activation transcriptionnel, ce qui induit inévitablement un biais lorsqu’on on utilise les données expérimentales de l’Immunoscope pour dénombrer de façon relative des populations cellulaires.
Après avoir brossé un panorama des évolutions de l’outil immunoscope, et souligné son importance, notamment dans le suivi des immunodéficiences en collaboration avec le Pr Alain Fisher, il conclue qu’il faut être à l’écoute des cliniciens et qu’il faut progresser avec des ajustements en permanence entre la complexité des RI, les développements technologiques, et le dialogue avec les cliniciens. Enfin il souligne l’intérêt d’avoir organisé cet atelier de façon conjointe entre une société de biotechnologie et les chercheurs et cliniciens appartenant à la SFI. «Pour le bien des malades, la porte est ouverte à de nouvelles approches complémentaires…». Le ton était donné, avec justesse, précision et grande sagesse…

La conférence s'est poursuivie à un rythme soutenu, par les interventions successives de plusieurs experts internationaux.

Guy Gorochov, nous a présenté des interrogations et résultats concernant l’étude des RI. Une des problématiques est la suivante : comment comparer deux RI. La stratégie originale mise  en place  par son équipe à partir de données Immunoscope a consisté à établir un profil de référence à partir de plusieurs sujets sains. Ensuite les RI sont soustraits à ce RI moyen afin d’obtenir un seul indicateur qui représente la perturbation du RI. Cette méthode a notamment permis de mettre en évidence la stabilisation des répertoires lymphocytaires chez les patients HIV+ recevant un traitement antiviral efficace. Elle sert de base d’analyse à d’autres groupes pour une approche globale de l’analyse du RI (voir résumé de la présentation de P. Miqueu). Il existe néanmoins de nombreuses limitations à ce type d'approche. Il est en effet difficile de définir précisément certaines sous-populations cellulaires. Par ailleurs, il existe des limitations méthodologiques liées à la qualité et à la représentativité des échantillons d’une part, et à la non linéarité des réactions de PCR, d’autre part. Selon Guy Gorochov, nous ne sommes pas encore à l’ère de l’application médicale en routine de l’analyse globale des RI. Pour l’heure son laboratoire d’immunomonitoring travaille sur des études longitudinales à l’échelon unicellulaire, par RT-PCR multiplex en particulier pour l’analyse des Tregs. Dans ce cas la diversité étudiée n’est pas une diversité globale. L’analyse repose sur la co-détection de Foxp3, des cytokines IL-10 et TGFß et des séquences CDR3. Il est ainsi possible de corréler la diversité à un type de population cellulaire. Les analyses basées sur ces distinctions phénotypiques indiquent que les répertoires des cellules T conventionnelles et de Treg sont en grande partie distincts.

Marie-Paule Lefranc nous a présenté IMGT®, le système d’information international en immunogénétique et immunoinformatique. IMGT® est la référence mondiale pour les gènes et protéines des immunoglobulines (IG) ou anticorps, des récepteurs T (TR) et du MHC de l’homme et des autres vertébrés. «Tous les travaux de R&D en immunogénétique et en ingénierie des anticorps ont besoin d’un très fort niveau de standardisation au niveau de la nomenclature des gènes et de la description des séquences et structures tri-dimensionnelles (3D). IMGT® est devenu indispensable pour les experts du domaine». Marie-Paule Lefranc nous a décrit un des systèmes phares d’IMGT®, IMGT/V-QUEST qui permet, en entrant une séquence V-(D)-J réarrangée d’IG ou de TR, d’identifier le nom des gènes et allèles V, D et J et de déterminer les mutations des IG. Grâce à ses outils intégrés, IMGT/V-QUEST fournit l’analyse détaillée des jonctions V-J et V-D-J (IMGT/JunctionAnalysis), la représentation graphique ou « IMGT Collier de Perles » des domaines variables et l’annotation exhaustive des séquences des utilisateurs (IMGT/Automat). IMGT/V-QUEST donne également les alignements et résultats protéiques avec la caractérisation des acides aminés selon les onze classes physicochimiques standardisées d’IMGT®. IMGT-V-QUEST compare jusqu’à 50 séquences réarrangées par analyse. Plus de vingt options sont disponibles pour l’utilisateur. Ceci fait gagner un temps considérable aux chercheurs. IMGT/V-QUEST est très utilisé par les cliniciens pour l’analyse des mutations dans les leucémies lymphoïdes chroniques et pour l’étude des répertoires immunitaires. Marie-Paule Lefranc a souligné que les mêmes standards sont appliqués aux séquences et aux structures 3D grâce à la numérotation unique IMGT. En particulier la numérotation unique des domaines V et C (des IG et TR) et des domaines G (du MHC) dans IMGT/Dstructure-DB permet, pour la première fois, une analyse standardisée des contacts dans les interactions anticorps/antigènes et TR/peptide/MHC.

Le Dr Patrick Miqueu a présenté les derniers résultats de la société TcLand Expression concernant la caractérisation des répertoires T de patients atteints de maladies auto-immunes et de patients transplantés rénaux. La présentation s’est focalisée sur le développement de méthodes statistiques dédiées à l’analyse des données issues de la technologie TcLandscape.  Cette technologie propriétaire explore la diversité du répertoire T en analysant l’expression des gènes Vb ainsi que les distributions de longueurs des régions CDR3 (données Immunoscope/Spectratyping associées aux quantités de transcrits). La robustesse des données a été illustrée par la réalisation de triplicats pour l’ensemble des gènes. Une vision intégrée de l’ensemble de ces données est assurée par la représentation TcLandscape. Deux types d’analyses statistiques ont été présentés : une étude longitudinale sur des patients atteints de sclérose en plaques et une étude de stratification de patients ayant subi une greffe rénale. Ces deux exemples ont été soumis à des analyses non supervisées : il s’agit de méthodes ne tenant pas compte de l’appartenance des échantillons à leurs groupes cliniques. Dans la première étude, des calculs de distances entre les différents profils ont été réalisés et corrélés avec les quantités de transcrits. L’analyse a permis d’établir des corrélations entre les variations du répertoire T et l’activité lésionnelle mesurée par IRM chez les patients atteints de sclérose en plaques. L’étude de stratification présentée concernait une cohorte de 250 patients ayant subi une greffe de rein. Cette étude a permis de différencier les patients tolérants leur greffe en l’absence de traitement immunosuppresseur aux patients présentant des signes de rejet chronique. Concernant les patients stables sous traitement immunosuppresseur, une stratification a pu être menée sur la base de leur TcLandscape suggérant que le répertoire pourrait être un marqueur du devenir à long terme du greffon.

Nicolas Pasqual à présenté les résultats et les innovations de la société ImmunID Technologies, notamment le test ImmunTraCkeR® basé sur de la PCR multi-N-plex au niveau de l’ADNg, ainsi que la méthode d’analyse NDL® développée sur les chaînes du TCR a, b, g, d, et la chaîne lourde des Ig chez l’homme et la souris. L’ImmunTraCkeR® mesure la diversité combinatoire V-J et permet plusieurs niveaux d’analyse en évitant les biais de transcription (car directement sur l’ADNg, un réarrangement au niveau ADN = une cellule) : 1/ évaluer le risque infectieux du patient, 2/ tout en suivant de manière résolutive d’éventuels clones de lymphocytes T ou B pouvant représenter la signature d’une pathologie. Grâce à une étude longitudinale chez un patient, il est possible de vérifier que ce dernier conserve bien un RI diversifié et homogène (moins de risque infectieux) tout en suivant l’efficacité du traitement d’immunothérapie sur les clones liés à la pathologie.  

« Nos récents résultats de suivi des lymphoproliférations et des immunodéficiences sont encourageants pour le diagnostic et l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. Visiblement ces nouveaux tests font gagner du temps aux biologistes en identifiant directement le nom des réarrangements V-J (sans besoin de séquencer) et en mesurant en parallèle le niveau d’immunodéficience du patient. Des études cliniques sur 350 patients sont en cours pour compléter ces données». ImmunID espère que d’ici quelques années, la technologie ImmunTraCkeR® permettra de répondre en quelques minutes seulement à la demande des cliniciens ayant besoin d’outils d’immunomonitoring pertinents et simples d’utilisation, pour adapter au mieux le traitement des patients en proposant le médicament adéquat, à la bonne dose et au bon moment. Des contrats avec l’Industrie pharmaceutiques indiquent le potentiel et la facilité de mise en œuvre de cette technologie. Une affaire à suivre…

Niek de Vries a décrit une nouvelle approche prometteuse, la technologie I-array®  (Immune Array), pour l’étude de la diversité de jonction par Puce à ADN. La technologie décrite dans PLOs One en décembre 2007, s’appuie sur le fait que lors de la recombinaison VDJ,  quelques bases sont enlevées et d’autres rajoutées au niveau des gènes V-D-J . Les oligonucléotides sur la puce ont une taille de 6 pb avec toutes les combinaisons possibles. De plus sur les réarrangements sont hybridés des « annealers » qui permettent de connaître le nombre de bases supprimées dans le gène V ou J. Cette approche à un seuil de détection trés fin et serait 2 logs plus sensible que Immunoscope à titre comparatif pour détecter l’infection à CMV.
L’objectif de cette puce n’est pas de permettre l’identification de la séquence mais de chercher rapidement des marqueurs pour les clones T et B avec une sensibilité supérieure à toutes les autres technologies actuelles. En ce moment cette technique pourrait s’avérer particulièrement efficace dans la recherche de maladies résiduelles. Même si cette approche est peut être encore onéreuse, son seuil de détection est prometteur. La validation actuelle d’un screening du répertoire complet  peut nous apporter un outil rapide et sensitif pour l’analyse des expansions clonales des lymphocytes dans le temps, dans differents tissues, et dans differentes populations de lymphocytes. Une autre affaire à suivre…

Adrien Six a présenté la stratégie ISEApeaks® permettant l’automatisation des analyses globales Immunoscope. Le logiciel ISEApeaks permet de créer une base de données de pics pour l’analyse de la diversité et de la perturbation d’un RI. Pour réaliser une étude des RI pertinente, il faut standardiser les approches pour établir des bases de données avec des informations comparables entre elles et si cela est possible, essayer de combiner l’étude du RI à d’autres approches d’immunomonitoring (ex : immunité innée). Adrien Six nous a présenté un travail sur l’étude de la diversité CDR3 des lymphocytes T lors de l’infection par plasmodium chez la souris. Des échantillons de sang et de rate de souris naïves ou de souris infectées développant des signes neurologiques (CM+) ou non (CM-) ont été analysés. Deux indices ont été utilisés pour estimer la perturbation des RI par rapport à un profil de référence : « Gorochov » un indice de perturbation globale ; et « Oligoscore » un indice indicateur d’expansion oligoclonale récurrente. Une analyse statistique et de clustering est ensuite effectuée. La méthode de clustering supervisée (k-mean clustering) permet de classer les profils sans à priori. Cette méthode visualise les résultats de façon intéressante: dans l’exemple montré, tous les échantillons de sang CM+ sont regroupés. Dans un second temps, une étude en cinétique a été menée. L’analyse a permis de mettre en évidence une augmentation significative de la perturbation au jour 5 dans la rate et au jour 6 dans le sang. Ces résultats démontrent qu’une étude biostatistique adéquate est primordiale pour mettre en évidence les biomarqueurs de l’infection.

Gilles Marodon a présenté ses tous derniers résultats montrant que l’étude du répertoire immunitaire permet de s’assurer de la qualité de la génération d'un système immunitaire humain chez les souris immuno-déficientes après injection de cellules souches CD34+ de sang de cordon. Les données montrent que les animaux présentent une diversité combinatoire proche de celle de l’homme, que ce soit pour les chaînes a et b du TCR ou pour les chaînes lourdes des Ig. L'étude du phénotype des différentes populations composant le système immunitaire a montré qu'une forte proportion de cellules naïves était retrouvée. Des études préliminaires montrent que le répertoire immunitaire diversifié corrobore une activité fonctionnelle des cellules humaines générées chez la souris après immunisation avec un candidat vaccin. Même si la méthode expérimentale est encore lourde, le taux de succès de reconstitution ainsi que l'homogénéité du répertoire immunitaire est encourageant pour que ce type de modèle puisse être un jour utilisé en pré-clinique. Au final, le fait de combiner le modèle de souris humanisées avec un immunomonitoring précis des répertoires immunitaires avec le test ImmunTraCkeR, semble prometteur, tant au niveau infectieux qu’au niveau cancéreux.

Rafick Sékaly, a présenté des données originales sur l’homéostasie de la réponse immunitaire au VIH pendant une HAART : du thymus à la périphérie. En préambule il a déclaré qu’il est particulièrement important lors d’une étude d’immunomonitoring des RI de lier diversité et fonctionnalité. Les travaux qu’il a menés reposent sur l’étude de la polyfonctionnalité des cellules T. Les fonctions des cellules qui sont étudiées sont la sécrétion d’IFN-g, d’Interleukines et de PD1. Il montre que la charge virale est corrélée à l’expression de PD1. Une forte expression de PD1 témoigne d’une charge virale élevée. Les cellules T CD8 au cours de l’infection au VIH, ne sont plus capables de générer des cellules mémoire et perdent à la fois de la diversité au niveau du répertoire T, et de la diversité fonctionnelle, qui ne se limite pas seulement à la production d’IFN-g. Il utilise la technologie des tétramères pour isoler les cellules CD8 spécifiques du VIH, et les étudier dans le temps au cours de l’infection, en analysant leur fonctionnalité, les voies de signalisation impliquées dans la mémoire, la présence de molécules anti-apoptotiques, et leur diversité directement par séquençage. Cette étude permet de montrer que la chute de la diversité est souvent due à la perte de multifonctionnalité et que la thérapie HAART restaure la réponse immunitaire, la fonctionnalité des cellules CD8+ et semble conduire à l’émergence de nouveaux clones T. D’où l’utilité de combiner les approches d’immunomonitoring…

Table Ronde… et Epilogue : Pierre Rafick Sékaly, Guy Gorochov, Nicolas Pasqual et Sylvia Cohen-Kaminsky

Vers une analyse du répertoire immunitaire au service des patients ?
L’atelier s’est poursuivi par une table ronde, au cours de laquelle des perspectives ont été évoquées autour de l’analyse globale des RI immunitaires. Il a été souligné les progrès des techniques de séquençage (technologie Solexa) permettant de séquencer des centaines de milliers de clones en un temps record. Mais le criblage à haut débit et le séquençage ne donnent pas la structure ni la fonction. Il faut arriver à jumeler fonction et oligoclonalité, encore que les réponses contre beaucoup de pathogènes soient polyclonales. La génération de ces données d’analyse globales des RI immunitaires pose le problème des bases de données spécifiques, et soulève la question de la résolution de la structure cristallographique à grande échelle. Aucune technique à l’heure actuelle ne permet de définir l’identité des chaînes TCR a et b sur les mêmes cellules, aucune technique n’est développée à l’échelon unicellulaire. Pour finir, l’idée a été soulevée par Nicolas Pasqual de créer un site web avec un système d’aiguillage pour aider l’utilisateur à faire des choix sur les approches technologiques les plus adaptées à son étude et à construire un programme de recherche autour de l’analyse des RI. En effet pour chaque situation physiopathologique, une combinaison d’approches complémentaires pourrait répondre de façon précise aux questions posées.

En conclusion, la présentation des développements autour de l’Immunoscope et des technologies ImmunTraCkeR et I-Array ont prouvé que le champ technologique de l’analyse globale des RI poursuit son développement. L’avenir nous dira si l’analyse globale des RI sera un jour à la portée du lit du malade… lien vers le programme de la conférence

Une autre application, plus subtile, concerne le comportement du système immunitaire du patient en phase de cancer.